来宝网 2024/12/30点击22次
摘要
本研究通过小细胞团和分散细胞混合物与两种带不同质粒的农杆菌共培养，成功将外源基因导入贡柑体胚，并通过DNA/DNA分子杂交鉴定确认基因整合与表达。构建了基于转化体胚的人工种子，并初步探讨了其萌发能力。本研究为柑桔类果树外源基因转移和遗传改良提供了重要参考。
引言
特性与价值
贡柑（Citrus nobilis Lour. Gonggan）是我国特有的柑橘地方农家优良品种，具有果形靓丽、果色金黄、皮薄核少、肉脆化渣、高糖低酸等特点，被誉为“中华柑王”。其优良的品质和独特的口感使得贡柑在市场上受到广泛欢迎，具有很高的经济价值。
构建遗传转化体系的意义
随着基因工程技术的发展，通过外源基因导入改良作物品种已成为现代育种的重要手段。构建贡柑的遗传转化体系，不仅可以提高贡柑的抗病虫害能力、耐逆境能力等，还可以实现对其品质性状的定向改良，从而满足市场对高品质柑橘的需求。
材料与方法
实验材料
植物材料：选取健康、生长旺盛的贡柑植株，取其幼胚作为外植体。
农杆菌菌株：携带质粒PGV3850:1103neo T-DNA（包含km抗性基因和Nos/Npt基因）和质粒PGV517（包含Km抗性基因、NPTⅡ基因和毒蛋白基因）的农杆菌。
培养基：含有卡那霉素的选择培养基，用于筛选抗性愈伤组织和幼胚。
实验方法
外植体准备：取贡柑幼胚，经过消毒处理后，用小细胞团和分散细胞混合物作为外植体。
共培养：将外植体与两种带不同质粒的农杆菌进行共培养，使外源基因导入贡柑细胞。
选择培养：在含有卡那霉素的选择培养基上选择出抗性愈伤组织和幼胚。
基因整合与表达检测：通过Nopalim和NPTⅡ酶性检测、DNA/DNA分子杂交鉴定，确认外源基因是否整合到贡柑体胚的细胞基因组中并表达。
人工种子制备：用3%海藻酸钠包埋转化体胚制备人工种子，并观察其萌发情况。
实验结果
抗性愈伤组织和幼胚的筛选
经过选择培养，成功从共培养的外植体中筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织和幼胚。这些抗性组织在后续的培养中保持了良好的生长状态。
基因整合与表达鉴定
通过Nopalim和NPTⅡ酶性检测，发现部分抗性愈伤组织和幼胚具有NPTⅡ酶活性，表明NPTⅡ基因已成功导入并表达。进一步的DNA/DNA分子杂交鉴定结果显示，Nos基因、NPTⅡ基因以及苏云金杆菌的毒蛋白基因已整合到贡柑体胚的细胞基因组中。
人工种子制备与萌发
用3%海藻酸钠包埋转化体胚制备了人工种子。在适宜的萌发条件下，2粒转基因人工种子成功萌发，表明所制备的人工种子具有萌发能力。
讨论
外植体关键因素
外植体的选择对于诱导体细胞胚的发生至关重要。在本研究中，选取了贡柑的幼胚作为外植体，这是因为幼胚具有较高的细胞全能性和胚性潜力，易于诱导形成体胚。此外，幼胚的发育程度对胚性愈伤组织的诱导也起决定性作用，因此在选择外植体时需要严格控制其发育阶段。
遗传转化策略
本研究采用了农杆菌介导的遗传转化方法，成功将外源基因导入贡柑体胚。这种方法具有操作简便、转化效率高等优点，是植物基因工程领域常用的转化策略之一。在转化过程中，质粒的选择和农杆菌菌株的侵染能力是影响转化效率的关键因素。本研究通过优化共培养条件和筛选高侵染力的农杆菌菌株，提高了外源基因的导入效率。
研究的创新与应用前景
创新点：本研究首次在柑桔类果树中实现了外源基因的转移和表达，并成功构建了基于转化体胚的人工种子。这一研究成果不仅丰富了柑桔类果树的遗传转化体系，还为后续的品质改良和抗病虫害育种提供了重要参考。
应用前景：通过外源基因的导入，可以实现对贡柑品质性状的定向改良，如提高糖度、降低酸度、增强抗病虫害能力等。此外，人工种子的制备为贡柑的产业化生产提供了新的途径，有望降低生产成本、提高生产效率。
结论
本研究通过小细胞团和分散细胞混合物与两种带不同质粒的农杆菌共培养的方法，成功将外源基因导入贡柑体胚，并通过DNA/DNA分子杂交鉴定确认了基因的整合与表达。同时，构建了基于转化体胚的人工种子，并初步探讨了其萌发能力。这一研究成果为柑桔类果树的外源基因转移和遗传改良提供了重要参考，具有广阔的应用前景。
