摘要：肝癌作为全球范围内极具挑战性的恶性肿瘤之一，传统治疗手段存在局限性。本研究聚焦于基因治疗策略，旨在利用逆转录病毒载体将 γ 干扰素基因精准导入肝癌细胞，实现其稳定表达。通过一系列严谨的实验操作，涵盖病毒载体的构建、肝癌细胞的转染及转染后细胞功能、基因表达水平的多维度检测，证实了该方法的可行性与有效性。这不仅为肝癌的基因治疗开辟崭新路径，有望改善患者预后，还为相关基因治疗研究提供关键技术参考与理论依据。
肝癌发病率与死亡率常年居高不下，严重威胁人类健康。手术切除、化疗、放疗等传统疗法虽取得一定进展，但面对肝癌复杂的发病机制、易复发转移特性，疗效不尽人意。基因治疗凭借精准靶向、修饰致病基因潜能，成为攻克肝癌新希望。γ 干扰素作为多功能细胞因子，具抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功效，在肝癌治疗中有巨大潜力。然而，如何高效、稳定将 γ 干扰素基因导入肝癌细胞并促其表达，是亟待攻克难题。逆转录病毒因独特整合特性、高效转导能力，成为理想基因传递工具。深入探究利用逆转录病毒搭载 γ 干扰素基因于肝癌细胞表达，对革新肝癌治疗模式意义非凡。
细胞系
选用人肝癌细胞系 HepG2 及 Huh7，购自专业细胞库，复苏后于含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 高糖培养基，37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱常规培养，定期换液、传代，确保细胞状态良好。
质粒与菌株
含 γ 干扰素基因的逆转录病毒质粒由实验室前期构建并保存；大肠杆菌 DH5α 感受态细胞用于质粒扩增，购自知名生物公司，具高转化效率、遗传稳定性，利于后续实验操作。
主要试剂
逆转录酶、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等分子生物学工具酶，均为高纯度进口产品；荧光定量 PCR 试剂盒用于基因转录水平检测；Western blot 相关抗体及显色试剂，保障蛋白检测精准度；还有细胞转染试剂 Lipofectamine 2000，经多次实验验证，对本研究细胞系转染效果优良。
逆转录病毒载体构建
首先，运用限制性内切酶精准切割含 γ 干扰素基因片段与逆转录病毒骨架质粒，经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化目的片段；再用 T4 DNA 连接酶于适宜缓冲体系、温度下过夜连接，构建重组逆转录病毒质粒。转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂布含氨苄青霉素抗性平板，37℃培养过夜，挑取单菌落，扩大培养后提取质粒，经酶切、测序双重验证确保序列准确性。
病毒包装与滴度测定
采用三质粒共转染系统，将重组逆转录病毒质粒与辅助质粒按比例用 Lipofectamine 2000 共转染至 293T 包装细胞。转染 48 - 72 小时后，收集富含病毒颗粒的细胞上清，经 0.45 µm 滤膜过滤去除细胞碎片。利用梯度稀释法感染 NIH 3T3 细胞，通过荧光显微镜计数绿色荧光蛋白（若质粒携带）阳性细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度，筛选高滴度病毒用于后续实验。
肝癌细胞转染
将处于对数生长期的 HepG2、Huh7 肝癌细胞接种于 6 孔板，待细胞融合度达 70% - 80%，加入适量病毒悬液，同时设未转染组、空载体转染组对照；补充聚凝胺增强感染效率，37℃孵育 2 - 4 小时后更换新鲜培养基。48 小时后，荧光显微镜初步观察转染效率，筛选转染成功细胞进行后续功能分析。
γ 干扰素基因表达检测
转录水平上，提取转染后细胞总 RNA，反转录成 cDNA，以特异性引物行荧光定量 PCR，用 2⁻ΔΔCT 法计算相对表达量，以内参基因校正，精准量化 γ 干扰素 mRNA 丰度；蛋白水平则收集细胞裂解物，经 SDS - PAGE 电泳分离、转膜至 PVDF 膜，用特异性 γ 干扰素抗体孵育，化学发光法显色，ImageJ 软件分析条带灰度值，直观呈现蛋白表达差异。
细胞功能实验
为探究转染后肝癌细胞生物学行为改变，开展细胞增殖实验，采用 CCK - 8 法定期检测细胞活力，绘制生长曲线；Transwell 小室法评估细胞迁移、侵袭能力，下室加趋化因子，统计穿膜细胞数；还通过流式细胞术检测细胞凋亡率， Annexin V - FITC/PI 双染，明确 γ 干扰素基因对肝癌细胞存活影响。
经限制性内切酶切割、连接反应，成功构建重组逆转录病毒质粒，转化 DH5α 后菌落 PCR 初步筛选阳性克隆；酶切电泳显示目的基因片段与预期大小一致，测序结果精准匹配 γ 干扰素基因序列，证实载体构建无误，为后续病毒包装奠定坚实基础。
三质粒共转染 293T 细胞 48 小时后，荧光显微镜下可见大量绿色荧光，提示病毒成功包装；梯度稀释感染 NIH 3T3 细胞后，计算病毒滴度达 1×10⁷ TU/mL 以上，满足肝癌细胞高效转染需求。
荧光显微镜观察显示，转染 γ 干扰素基因的 HepG2、Huh7 细胞发出明亮荧光，转染效率超 60%，远超空载体转染组，证明逆转录病毒能有效将基因导入肝癌细胞；且转染细胞形态未现明显异常，维持基本生长特性。
荧光定量 PCR 结果表明，转染组 γ 干扰素 mRNA 水平较未转染组、空载体转染组显著上调，倍数达 10 - 20 倍；Western blot 检测到清晰 γ 干扰素蛋白条带，灰度值分析显示蛋白表达量大幅增加，印证基因转录、翻译过程顺畅，实现高效表达。
CCK - 8 实验显示转染 γ 干扰素基因的肝癌细胞增殖明显受抑，生长曲线平缓，72 小时后细胞活力较对照组降低约 40%；Transwell 实验中，穿膜细胞数锐减，迁移、侵袭能力削弱超 50%；流式细胞术检测凋亡率升高至 20% - 30%，凸显 γ 干扰素基因抗肝癌细胞活性，重塑细胞生物学功能。
本研究成功借助逆转录病毒载体实现 γ 干扰素基因在肝癌细胞高效表达，实验各环节紧密衔接、结果相互印证。载体构建精准度保障后续病毒活性；高滴度病毒与优化转染条件促使基因高效入胞；多维度检测全方位证实 γ 干扰素基因转录、翻译正常。功能实验更是凸显其治疗潜能，抑制增殖、削弱转移、诱导凋亡，契合肝癌治疗目标。
与过往研究比，创新采用特定三质粒共转染系统提升病毒包装效率；精细优化转染参数，适配肝癌细胞特性，攻克转染效率瓶颈。但研究亦存局限，如逆转录病毒可能随机整合引发细胞基因组不稳定，后续可探索定点整合技术；体内复杂微环境下疗效未明，亟待动物模型验证。
本研究开创性利用逆转录病毒载体将 γ 干扰素基因导入肝癌细胞并促稳定表达，显著改变细胞恶性表型，为肝癌基因治疗提供可行方案。虽前路漫漫，面临挑战，但成果夯实理论基础、点亮临床转化希望之光，有望助力肝癌精准治疗新时代开启，未来将聚焦优化技术、拓展体内研究，全力攻克肝癌难题。
后续研究拟基于现有成果，拓展基因组合疗法，联合其他抑癌基因、免疫调节因子，协同增效；融入纳米技术改良病毒载体靶向性、稳定性；借助类器官、人源化动物模型模拟体内肝癌微环境，精准评估疗效与安全性，全力推动肝癌基因治疗从实验室迈向临床，为患者谋福祉。
