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前言

类器官已成为生命科学和医学研究领域的“明星模型”，在疾病机制研究、药物筛选、精准医疗等方面展现出巨大潜力。然而，许多科研人员在尝试类器官培养时，常常面临“无法形成结构”、“细胞活性低”、“传代失败”等问题。

探究其根本，培养体系中细胞因子的选择和配比可能是成败的关键！

接下来，我们将会结合类器官经典培养方案WENR（Wnt3a、EGF、Noggin、R-Spondins），解析“四大护法”如何各显神通，助你攻克类器官培养难关！

01 WENR何以成为类器官培养经典？

类器官的经典培养方案WENR（或称为WNER）最初由荷兰Hubrecht研究所的Hans Clevers团队开发，其核心成分包括Wnt-3a、EGF、Noggin和R-Spondins。常被称为类器官培养的“四大护法”。

WENR方案在类器官的研究与实践中不断演化，通过与其他细胞因子或小分子抑制剂的巧妙结合，衍生出适用于多种类器官构建的培养条件。目前，WENR方案已在胃、小肠、结肠、胰腺、肝脏等多种类器官培养中得到广泛应用。

WENR方案用于多种类器官培养（源自Bindi M. Doshi, PhD. www.labroots.com）

02 WENR“四大护法”

1 Wnt-3a：干细胞增殖的“发动机”

Wnt-3a作为经典Wnt通路的激活剂，通过稳定β-catenin蛋白，启动下游靶基因（如c-Myc、Cyclin D1），参与细胞发育、增殖和分化过程。Alessandra Merenda在其综述中深入总结了Wnt信号通路在类器官领域的关键作用。文中指出，无论成体干细胞组织来源如何，其衍生的类器官在增殖、干性维持及终末分化特化细胞等关键环节，都依赖于经典Wnt信号通路。如在小鼠结肠类器官的建立过程中，添加外源性Wnt-3a对其增殖至关重要。不添加Wnt-3a，类器官超过3天后无法存活。

Wnt-3a在肠类器官中培养中的作用（源自文献：doi: 10.1016/j.tcb.2019.10.003）

2 EGF：细胞增殖的“加速器”

表皮生长因子（EGF）与受体结合，激活MAPK/ERK通路，促进细胞增殖和存活。EGF刺激上皮细胞增殖、血管生成和表皮细胞分化，促进类器官三维结构的形成。EGF广泛应用于胃肠道、肝脏、甲状腺等类器官培养，促进细胞集落形成和组织结构稳定性。尽管EGF并非类器官形成的必需因子，但能显著增加类器官体积。

优化的WENR方案在人胃肠道类器官构建过程中的应用（源自文献：doi: 10.1186/s13619-020-00040-w）

3 Noggin：抑制分化的“守门员”

在类器官构建过程中，Noggin与细胞增殖密切相关。Noggin是一种骨形态发生蛋白（BMP）的内源性抑制剂，通过阻断BMP与受体结合，促进干细胞增殖，为类器官形成提供充足的细胞。Noggin还通过抑制BMP信号通路，维持干细胞干性，影响细胞的命运决定和分化过程。

在类器官培养中，Noggin常与Wnt-3a和R-Spondins一起使用，以平衡BMP和Wnt信号通路，促进类器官的生长和分化。因此，Noggin在类器官培养中不仅促进增殖，还精细调控细胞的分化。

Noggin抑制细胞增殖的分子机制（源自文献：doi: 10.1242/bio.20149977）

4 R-Spondins：Wnt信号的“放大器”

R-spondin是Wnt信号通路的激活剂，通过与Frizzled和LRP5/6受体结合，增强Wnt信号在多种组织中的表达，促进干细胞增殖与类器官结构形成。T. Thalheim等人发现，没有R-spondin时，类器官在4-5天后停止生长。在1.2% R-spondin浓度下培养的类器官生长非常迅速，生长时间超过5天后经常破裂，其管腔内积累了大量细胞碎片。在10%或25% R-spondin浓度下培养的类器官生长速度比1.2%稍慢，但不会破裂。

不同浓度的R-spondin影响肠类器官的生长状态（源自文献：doi: 10.1016/j.ydbio.2017.10.013）

03 WENR实战避坑Tips

Wnt过度激活会导致类器官结构紊乱，因此Wnt-3a浓度需严格控制。并且R-spondin需要和Wnt-3a协同使用，单独使用效果有限。建议根据类器官类型优化Wnt-3a的浓度，一般为50-100 ng/mL。在培养后期也可以动态调控其浓度。

EGF易被蛋白酶降解，建议使用无血清培养基。EGF长期高浓度，可能会诱导异常分化，建议定期更换培养基。EGF一般使用浓度为50 ng/mL。在肿瘤类器官（如肠癌）中，其浓度需根据癌细胞特性调整。

Noggin与Wnt-3a协同作用，支持胃、肠道、肝脏、肺、胰腺等类器官的长期培养。在肺类器官培养中，Noggin缺失会导致肺泡上皮细胞过早分化。在肝类器官中，其与Wnt3a的“双剑合璧”是长期传代的关键。BMP信号的过度激活会导致类器官形成囊状结构，失去功能性隐窝结构。

S-spondin有4个亚型（RSPO1-4），不同组织来源的类器官可能需特异性选择。Wnt-3a和R-spondin易失活，建议分装后-80℃保存。

常见问题排查表，仅供参考：

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【参考文献】

1、 Nick Barker, et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 2010. doi: 10.1016/j.stem.2009.11.013.

2、 Toshiro Sato, Hans Clevers. SnapShot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 2015. doi: 10.1016/j.cell.2015.06.028.

3、Bindi M. Doshi, PhD. Crucial Niche Factors for Organoid Cultures. www.labroots.com

4、JuneSung Bae, et al. The Patient-Derived Cancer Organoids: Promises and Challenges as Platforms for Cancer Discovery. Cancers (Basel). 2022. doi: 10.3390/cancers14092144.

5、Alessandra Merenda, Nicola Fenderico, Madelon M Maurice. Wnt Signaling in 3D: Recent Advances in the Applications of Intestinal Organoids. Trends Cell Biol, 2020. doi: 10.1016/j.tcb.2019.10.003.

6、Zhang, M., Liu, Y. & Chen, YG. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regen, 2020. https://doi.org/10.1186/s13619-020-00040-w

7、Kimberly A Wong, et al. Efficient retina formation requires suppression of both Activin and BMP signaling pathways in pluripotent cells. Biol Open, 2015. doi: 10.1242/bio.20149977.

8、Torsten Thalheim, et al. Linking stem cell function and growth pattern of intestinal organoids. Developmental Biology, 2018. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2017.10.013